Typer fluorescensmikroskop
Da mikroskop ble oppfunnet rundt 1600 e.v.t., vendte naturfilosofene blikket mot en verden i en verden. Da Antony van Leeuwenhoek laget små, meget buede linser og en mekanisk holder for å justere utsikten, åpnet han et vindu mot den mikroskopiske verdenen av bakterier, blodceller, protozoer og plantestrukturen. Men gjennom historien om mikroskopi har det alltid vært ett spørsmål: Hva er disse rare tingene sett gjennom en linse? Fluorescensmikroskopi refererer til et sett med teknikker som minimerer den usikkerheten - fordi det i fluorescensmikroskopi når lys skinner på en prøve, skinner sitt eget lys med en gang tilbake.
Epifluorescens
Det desidert vanligste fluorescensmikroskopet er epifluorescens-konfigurasjonen. I et epifluorescensmikroskop skinner en lyskilde - vanligvis en kvikksølv- eller xenonlampe - gjennom et filter som velger et smalt område med bølgelengder. Det filtrerte lyset skinner på prøven gjennom objektivets objektiv. Det innkommende lyset absorberes av fluoroforer - molekylære merker som avgir lys med lang bølgelengde når de absorberer lys med kortere bølgelengde. Lys fra fluoroforene, sammen med spredt lys fra lyskilden, går tilbake i objektivlinsen og til detektoren eller øyet. Underveis blokkerer et annet filter ut lyset, så alt som er igjen er det fluorescerende lyset fra prøven.
Konfokal
Et epifluorescensmikroskop samler lys fra overalt i synsfeltet til mikroskopet. Noe av eksitasjonslyset absorberes før mikroskopets fokalplan, noe i fokalplanet og noe utenfor fokalplanet. Fordi mikroskopet samler alt det lyset, vil bildet inneholde et skarpt lysbilde i fokus, men det vil også ha lys utenfor fokus fra andre regioner. Et konfokalmikroskop fikser det ved å fokusere et laserpunkt i samme plan som mikroskopet er fokusert. Deretter går et pinhull foran detektoren, der den blokkerer alt lyset som ikke kommer fra mikroskopfokuset. Ved å skanne prøven kan du få et rent tredimensjonalt bilde av objektet.
Multiphoton
I et konfokalt mikroskop er justeringen veldig følsom. Hvis laserpunktet, mikroskopmålet, samleoptikken og pinhullet er av, til og med den minste mengden mikroskopytelsen lider. Et multiphoton-mikroskop omgår dette problemet ved å bruke en laserbølgelengde som bare er halvparten så energisk som det trenger å være for å begeistre fluoroforene i prøven. Den eneste måten fluoroforene blir begeistret for og sender ut fluorescens er hvis laserlyset er sterkt nok til at to lyspartikler - fotoner - treffer fluoroforen på veldig kort tid. Det skjer bare når laseren er fokusert til et veldig lite sted. Så det eneste stedet i prøven som vil avgi lys er hvor laseren er fokusert, noe som holder bildet pent og rent fordi det ikke er noe ekstra bakgrunnslys å bli kvitt - noe som betyr at det ikke er noen pinhull å justere.
Total intern refleksjon fluorescens (TIRF)
En annen måte å få veldig rene bilder på er å sørge for at eksitasjonslyset ikke kommer veldig langt inn i prøven. Hvis for eksempel en klump av nevroner plasseres i en dråpe løsning på et glass, vil noen av nevronene feste seg til glassoverflaten. I et totalt internt refleksjonsfluorescensmikroskop (TIRF) blir lyset ledet sidelengs inn i glassplaten, slik at det ikke virkelig kommer inn i løsningen som holder cellene. Men noe av lyset lekker nesten ikke inn i løsningen - bare veldig nær glassets overflate. Dette betyr at de eneste stedene som vil avgi lys vil være i et veldig tynt område rett opp mot glassoverflaten. For noe som nevroner, hvor det skjer så mye interessant på overflaten av cellene, kan denne teknikken være veldig effektiv.
Superoppløsning
Alle mikroskop - inkludert fluorescensmikroskop - er begrenset av fysikken som styrer forplantningen av lys. En av de grunnleggende reglene er at et fokusert lyspunkt bare kan bli så lite - og ikke mindre. For synlig lys er størrelsen omtrent 200 nanometer, eller 200 milliarddeler av en meter. Men enkeltmolekyler har bare noen få nanometer i størrelse, så det er mange interessante funksjoner som er under den størrelsesgrensen, kalt diffraksjonsgrensen. Forskere utvikler "superoppløsnings" teknikker for å snike seg rundt den grensen. Strukturert belysningsmikroskopi (SIM) og stimulert utslippsmangel (STED) -mikroskopi er for eksempel begge fluorescensmikroskopimetoder som begrenser størrelsen på det lysemitterende stedet ved å krympe størrelsen på eksitasjonslyspunktet.
